Jak pierwszy doustny inhibitor Mac1 zmienia podejście do leczenia COVID-19?

Naukowcy opracowali AVI-6451 – pierwszy doustnie biodostępny inhibitor makrodomeny Mac1 wirusa SARS-CoV-2, który wykazuje potężną aktywność przeciwwirusową. W badaniach na myszach zakażonych wirusem nowy związek osiągnął czterologową redukcję poziomu wirusa w płucach w ciągu zaledwie czterech dni od rozpoczęcia leczenia. Co istotne, lek działa poprzez przywrócenie naturalnych mechanizmów odpornościowych organizmu, które wirus próbuje wyłączyć za pomocą białka Mac1.

Kluczowym przełomem jest wysoka biodostępność doustna wynosząca 61% u myszy, co oznacza, że znaczna część przyjętego doustnie leku dociera do krwioobiegu i może skutecznie działać. Wcześniejsze związki z tej grupy wymagały podawania drogą dożylną i charakteryzowały się biodostępnością poniżej 5%. Nowy inhibitor utrzymuje stężenie terapeutyczne we krwi przez pełne 24 godziny po jednorazowym podaniu, umożliwiając wygodne dawkowanie raz dziennie.

Badania porównawcze wykazały, że AVI-6451 przewyższa wcześniejszy związek wiodący (AVI-4206) pod względem skuteczności. Przy połowie całkowitej dawki i podaniu doustnym zamiast dożylnego, nowy lek osiągnął lepszą redukcję poziomu wirusa już w drugim dniu po zakażeniu. W testach na ludzkich makrofagach AVI-6451 wykazywał aktywność przeciwwirusową w zakresie nanomolowym, podczas gdy wcześniejsze związki wymagały stężeń mikromolowych dla podobnego efektu – różnica tysiąckrotna.

Mechanizm działania opiera się na blokowaniu aktywności enzymatycznej Mac1 – makrodomeny będącej częścią białka niestrukturalnego NSP3 wirusa. Mac1 funkcjonuje jako enzym usuwający znaczniki chemiczne instalowane przez białka obronne gospodarza w odpowiedzi na infekcję wirusową. Zablokowanie tej aktywności przywraca sygnalizację interferonową i umożliwia układowi odpornościowemu skuteczne rozpoznanie i zwalczenie wirusa.

Jak molekularna budowa AVI-6451 determinuje jego skuteczność?

Zespół badawczy przeprowadził systematyczną optymalizację chemiczną struktury inhibitora, rozpoczynając od dwóch odrębnych szkieletów molekularnych. Kluczowym wyzwaniem było wyeliminowanie problemu wysokiego wypływu komórkowego mediowanego przez transporter P-gp, który powodował, że wcześniejsze związki były szybko usuwane z komórek. Naukowcy zidentyfikowali, że grupa mocznikowa w pozycji C8 szkieletu pirymidoindolowego przyczyniała się zarówno do słabej przepuszczalności, jak i rozpoznawania przez P-gp.

Przełomem okazała się zamiana polarnej grupy mocznikowej na prosty pierścień cyklopropylowy w pozycji C8. Ta modyfikacja zredukowała liczbę donorów wiązań wodorowych z pięciu do trzech i obniżyła topologiczną powierzchnię polarną z 119 do 69 Ų. Przepuszczalność przez błony komórkowe wzrosła dramatycznie – z 0,023×10⁻⁶ cm/s do 13,6×10⁻⁶ cm/s w testach Caco-2. Jednocześnie współczynnik wypływu spadł z wartości przekraczającej 200 do zaledwie 2,9, co oznacza praktyczne wyeliminowanie problemu aktywnego usuwania leku z komórek.

Dodatkowo wprowadzono atom fluoru w pozycji C6 pierścienia indolowego, co poprawiło powinowactwo do Mac1 bez pogorszenia właściwości farmakokinetycznych. Struktury krystalograficzne kompleksów inhibitor-białko ujawniły, że pierścień cyklopropylowy tworzy korzystne kontakty z hydrofobową kieszenią znajdującą się powyżej kluczowego aminokwasu Asp22. Spolaryzowane wiązania C-H cyklopropanu wchodzą w interakcje z powierzchnią karbonylową Asp22, co wyjaśnia, dlaczego cyklopropyl jest dziesięciokrotnie skuteczniejszy niż izosteryczna grupa trifluorometylowa.

W pozycji C4 zachowano pierścień oksazolidynonu, który tworzy bezpośrednie wiązania wodorowe z grupami NH szkieletu aminokwasów Phe156 i Asp157 w miejscu wiązania rybozy. Ta interakcja naśladuje kontakty tworzone przez naturalny substrat ADP-rybozę. Kombinacja zoptymalizowanych podstawników w pozycjach C4, C6 i C8 zaowocowała związkiem o wartości IC₅₀ wynoszącej 28 nM w teście wypierania liganda, co odpowiada potencji wiodącego związku z grupą mocznikową przy znacznie lepszym profilu farmakokinetycznym.

Jakie dowody przedkliniczne potwierdzają skuteczność przeciwwirusową AVI-6451?

W badaniach farmakokinetycznych na myszach CD1 AVI-6451 wykazał wyjątkowo korzystny profil. Po doustnym podaniu 50 mg/kg wolne stężenie w osoczu utrzymywało się powyżej wartości IC₅₀ przez pełne 24 godziny. Klirens metaboliczny był niezwykle niski – 0,242 L/h/kg, co stanowi zaledwie około 3% przepływu krwi przez wątrobę. Okres półtrwania w osoczu wynosił około 4 godzin, a biodostępność doustna osiągnęła 61%, co jest wartością wyjątkową dla związku o tej strukturze chemicznej.

W badaniach stabilności metabolicznej AVI-6451 wykazał niski klirens zarówno w mikrosomach wątrobowych myszy (poniżej 11,6 µL/min/mg), jak i człowieka. Wiązanie z białkami osocza wynosiło umiarkowane 72%, co zapewnia odpowiedni stosunek frakcji wolnej do związanej. Testy przepuszczalności Caco-2 potwierdziły wysoką wartość przy niskim współczynniku wypływu (ER = 2,9), co wskazuje na doskonałe właściwości absorpcyjne w przewodzie pokarmowym.

Kluczowe badanie skuteczności przeprowadzono na dzikiego typu myszach zakażonych mysio-adaptowanym szczepem SARS-CoV-2 (MA-WA1). Myszy otrzymywały AVI-6451 doustnie raz dziennie w dawce 100 mg/kg lub AVI-4206 dożylnie dwa razy dziennie w dawce 100 mg/kg. Grupa kontrolna otrzymywała nośnik, a dodatkowa grupa kontrolna została zakażona mutantem wirusowym Mac1 N40D pozbawionym aktywności enzymatycznej makrodomeny. Miareczkowanie wirusa w płucach przeprowadzono metodą plaque assay w dniach 2 i 4 po zakażeniu.

Wyniki wykazały, że w drugim dniu po zakażeniu AVI-6451 spowodował większą redukcję miana wirusowego niż AVI-4206, osiągając efekt porównywalny z zakażeniem mutantem N40D. W czwartym dniu AVI-6451 zredukował poziom wirusa o około 4 logi (dziesięciotysięczną redukcję) w porównaniu z kontrolą, podczas gdy AVI-4206 osiągnął redukcję około 3 logów. Co istotne, jednokrotne dawkowanie doustne AVI-6451 okazało się skuteczniejsze niż dwukrotne dawkowanie dożylne AVI-4206 przy tej samej całkowitej dawce dobowej, co potwierdza przewagę nowego związku.

Czy nowy inhibitor charakteryzuje się odpowiednią selektywnością i bezpieczeństwem?

Profil bezpieczeństwa AVI-6451 oceniono w panelu SafetyScreen44 obejmującym 44 powszechne cele pozacelowe, w tym receptory, kanały jonowe i enzymy. W stężeniu 10 µM (około 350-krotnie wyższym niż IC₅₀ dla Mac1) związek wykazał odpowiedź powyżej 50% tylko dla trzech celów: fosfodiesterazy PDE4D2 (51%), receptora adenozynowego A₂A (56%) i receptora serotoninowego 5-HT₂B (56%). Ten profil jest porównywalny do wcześniejszego związku wiodącego AVI-4206, który w analogicznym teście wykazywał jeszcze większą selektywność.

W panelu enzymów cytochromu P450 AVI-6451 wykazał umiarkowaną inhibicję CYP2C8 i CYP2C19 w stężeniu 10 µM, co było silniejsze niż dla AVI-4206. Te izoformy są odpowiedzialne za metabolizm niektórych leków, co może mieć znaczenie kliniczne i wymaga dalszej oceny w kontekście potencjalnych interakcji lekowych. Brak istotnej inhibicji CYP3A4, najważniejszego enzymu metabolizującego leki, jest korzystnym odkryciem.

Wcześniejsze badania przesiewowe AVI-4206 w stężeniu 10 µM obejmowały panel około 300 kinaz, proteaz i innych enzymów. Związek ten wykazał wyjątkowo korzystny profil selektywności z minimalną aktywnością poza celem. Podobna struktura chemiczna AVI-6451, różniąca się głównie podstawnikiem w pozycji C8, sugeruje zachowanie tej wysokiej selektywności, choć wprowadzenie bardziej hydrofobowego pierścienia cyklopropylowego nieznacznie zwiększyło ryzyko interakcji pozacelowych z CYP2C.

W badaniach tolerancji na myszach nie zaobserwowano objawów toksyczności przy najwyższej testowanej dawce 100 mg/kg podawanej doustnie raz dziennie przez pięć dni. Zwierzęta zachowywały prawidłową masę ciała i nie wykazywały oznak dystresu. Farmakokinetyka była liniowa w zakresie dawek 10-100 mg/kg, co wskazuje na brak nasycenia mechanizmów wchłaniania i eliminacji. Wolne stężenia w osoczu pozostawały powyżej IC₅₀ przez ponad 24 godziny nawet przy najniższej testowanej dawce.

Dlaczego inhibitory Mac1 stanowią innowacyjne podejście w leczeniu COVID-19?

Pandemia COVID-19 uwypukliła pilną potrzebę skutecznych leków przeciwwirusowych działających przez nowe mechanizmy. Większość zatwierdzonych terapii celuje w replikację wirusową – bezpośrednio hamuje namnażanie wirusa poprzez blokowanie jego enzymów replikacyjnych lub wbudowywanie wadliwych nukleotydów do materiału genetycznego. Inhibitory Mac1 reprezentują fundamentalnie odmienną strategię: zamiast atakować sam wirus, przywracają naturalną zdolność organizmu do jego zwalczania.

Genetyczne badania walidacyjne dostarczyły przekonujących dowodów na celowość terapeutyczną Mac1. Wirusy SARS-CoV-2 niosące delecje lub inaktywujące mutacje w makrodomenie Mac1 wykazują dramatycznie obniżoną chorobotwórczość u myszy, mimo zachowania zdolności do replikacji. To wskazuje, że Mac1 nie jest niezbędna do namnażania wirusa, ale odgrywa kluczową rolę w wyłączaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza, szczególnie szlaku sygnalizacji interferonowej.

Funkcja Mac1 jako enzymu usuwającego znaczniki ADP-rybozy polega na usuwaniu modyfikacji instalowanych przez białka PARP gospodarza na białka sygnalizacyjne. Ta modyfikacja potranslacyjna jest kluczowym elementem wrodzonej odpowiedzi przeciwwirusowej, aktywującym szlaki interferonowe i inne mechanizmy obronne. Usuwając te znaczniki, Mac1 skutecznie wyłącza alarm immunologiczny, pozwalając wirusowi na niezakłóconą replikację we wczesnych fazach zakażenia.

Blokowanie aktywności Mac1 przywraca naturalną kaskadę sygnalizacyjną interferonu, co prowadzi do produkcji białek antywirusowych i aktywacji komórek odpornościowych. W praktyce oznacza to, że organizm sam eliminuje zakażenie przy wsparciu farmakologicznym, zamiast polegać wyłącznie na bezpośrednim działaniu przeciwwirusowym leku. To podejście może być szczególnie skuteczne w połączeniu z innymi terapiami – inhibitor Mac1 odblokowuje odpowiedź immunologiczną, podczas gdy klasyczne leki przeciwwirusowe bezpośrednio hamują replikację.

Model mysio-adaptowany MA-WA1 użyty w badaniach skuteczności lepiej odzwierciedla przebieg choroby płucnej niż wcześniej stosowany model K18-hACE2, w którym śmiertelność wynika głównie z inwazji wirusa do ośrodkowego układu nerwowego. Wyraźna redukcja miana wirusowego w płucach potwierdza, że przywrócenie funkcji immunologicznych przez inhibicję Mac1 przekłada się na rzeczywistą kontrolę zakażenia w docelowej tkance.

Co to odkrycie oznacza dla przyszłości terapii przeciwwirusowych?

Opracowanie AVI-6451 stanowi ważny dowód koncepcji dla celowania w makrodomeny wirusowe jako strategii terapeutycznej. Przez ponad dwa lata od początku pandemii COVID-19 poszukiwanie potężnych, selektywnych i doustnie biodostępnych inhibitorów Mac1 pozostawało wyzwaniem nierozwiązanym przez wiele zespołów badawczych na świecie. Systematyczne podejście do optymalizacji właściwości farmakokinetycznych, szczególnie eliminacja problemu wysokiego wypływu mediowanego przez P-gp, dostarczyło cennych wskazówek dla projektowania leków celujących w białka wirusowe.

Kluczowym spostrzeżeniem było odkrycie, że prosta grupa hydrofobowa (cyklopropyl) może skutecznie zastąpić polarną funkcję mocznikową bez utraty powinowactwa do białka docelowego. Badania termodynamiczne metodą kalorymetrii izotermicznej ujawniły, że choć wiązanie grupy mocznikowej jest entropicznie korzystniejsze (prawdopodobnie przez uwalnianie większej liczby cząsteczek wody), usunięcie otoczki wodnej z tej polarnej grupy jest na tyle kosztowne energetycznie, że ogólny bilans termodynamiczny pozostaje porównywalny. To przeciwstawia się intuicyjnemu założeniu, że więcej wiązań wodorowych zawsze oznacza silniejsze wiązanie.

Struktury krystalograficzne kompleksów inhibitor-Mac1 dostarczyły szczegółowego wglądu w molekularne podstawy wiązania. Orientacja Asp22 różni się znacząco między kompleksami z grupą mocznikową a cyklopropylem, co wskazuje na plastyczność miejsca wiązania i możliwość wykorzystania alternatywnych trybów interakcji. Spolaryzowane wiązania C-H cyklopropanu tworzące kontakty z powierzchnią karbonylową Asp22 reprezentują interesujący przykład niekonwencjonalnych wiązań wodorowych, które mogą być celowo wykorzystywane w projektowaniu leków.

Podejście metodologiczne łączące przesiewanie oparte na kształcie molekularnym, krystalografię strukturalną, kalorymetrię izotermiczną i obliczenia kwantowe ilustruje moc zintegrowanego podejścia do odkrywania leków. Każda technika dostarczała komplementarnych informacji niezbędnych do zrozumienia relacji struktura-aktywność i racjonalnej optymalizacji właściwości farmakologicznych. Ten wielodyscyplinarny model współpracy może służyć jako wzorzec dla przyszłych programów odkrywania leków.

Szerszy kontekst obejmuje rosnące zainteresowanie celowaniem w mechanizmy ucieczki immunologicznej wirusów jako strategii terapeutycznej. Tradycyjne leki przeciwwirusowe celują bezpośrednio w funkcje niezbędne do replikacji wirusa, co często prowadzi do szybkiego rozwoju oporności przez mutacje w miejscach wiązania. Inhibitory Mac1 działają pośrednio – przywracają zdolność układu odpornościowego do rozpoznania i eliminacji zakażenia, co może być trudniejsze do obejścia przez ewolucję wirusową, szczególnie jeśli funkcja Mac1 jest ważna dla chorobotwórczości.

Czy doustny inhibitor Mac1 otwiera nową erę w leczeniu COVID-19?

Opracowanie AVI-6451 jako pierwszego doustnie biodostępnego i skutecznego inhibitora makrodomeny Mac1 SARS-CoV-2 stanowi znaczący postęp w walce z COVID-19. Związek wykazuje potężną aktywność przeciwwirusową osiągając czterologową redukcję poziomu wirusa w modelach zwierzęcych przy jednorazowym dawkowaniu dziennym. Kluczowym osiągnięciem było przezwyciężenie problemu wysokiego wypływu komórkowego przez strategiczną zamianę polarnej grupy mocznikowej na hydrofobowy pierścień cyklopropylowy, co dramatycznie poprawiło przepuszczalność i biodostępność bez utraty aktywności. Mechanizm działania poprzez przywrócenie naturalnej odpowiedzi immunologicznej reprezentuje innowacyjne podejście komplementarne do klasycznych leków przeciwwirusowych.

Badania genetyczne potwierdzające krytyczną rolę Mac1 w patogenezie oraz porównywalne efekty farmakologicznej inhibicji i mutanta enzymatycznie nieaktywnego dostarczają solidnej walidacji celu terapeutycznego. Doskonały profil farmakokinetyczny – niski klirens, długi czas utrzymywania stężenia terapeutycznego i wygodne dawkowanie – czynią AVI-6451 wartościowym narzędziem badawczym i obiecującym kandydatem do dalszego rozwoju. Choć pozostają wyzwania związane z umiarkowaną inhibicją niektórych enzymów cytochromu P450 i koniecznością przeprowadzenia badań klinicznych u ludzi, osiągnięcia przedstawione w tej pracy stanowią ważny krok naprzód.

Zintegrowane podejście metodologiczne łączące chemię medyczną, biofizykę i badania przedkliniczne może służyć jako model dla przyszłych programów odkrywania leków celujących w mechanizmy ucieczki immunologicznej wirusów. Perspektywa terapii skojarzonej inhibitorów Mac1 z zatwierdzonymi lekami przeciwwirusowymi otwiera obiecujące możliwości skuteczniejszego leczenia COVID-19 i przygotowania na przyszłe pandemie koronawirusowe. Makrodomeny występują nie tylko w koronawirusach, ale także w innych wirusach RNA, co sugeruje potencjalnie szersze zastosowanie tej klasy inhibitorów w przyszłości.

Pytania i odpowiedzi